lateral ultrassensível

May 02, 2023

Nature Biomedical Engineering (2023) Citar este artigo

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Detalhes das métricas

Os ensaios de fluxo lateral (LFAs) são rápidos e baratos, mas são quase 1.000 vezes menos sensíveis do que os testes laboratoriais. Aqui, mostramos que os nanobastões de ouro fluorescentes conjugados com anticorpos plasmonicamente ativos podem tornar os LFAs convencionais ultrassensíveis. Com tempos de amostra para resposta dentro de 20 min, os LFAs plasmonicamente aprimorados lidos por meio de um scanner de fluorescência de bancada padrão atingiram melhorias de cerca de 30 vezes na faixa dinâmica e nos limites de detecção em ensaios imunoenzimáticos padrão ouro de 4 horas de duração, e alcançou 95% de sensibilidade clínica e 100% de especificidade para anticorpos no plasma e para antígenos em swabs nasofaríngeos de indivíduos com síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2). Melhorias comparáveis ​​no desempenho do ensaio também podem ser alcançadas por meio de um scanner portátil barato, como mostramos para a detecção de interleucina-6 em amostras de soro humano e da proteína do nucleocapsídeo de SARS-CoV-2 em amostras nasofaríngeas. Os LFAs plasmonicamente aprimorados superam os testes laboratoriais padrão em sensibilidade, velocidade, faixa dinâmica, facilidade de uso e custo e podem oferecer vantagens em diagnósticos no local de atendimento.

Os ensaios de fluxo lateral (LFAs) estão entre os métodos de diagnóstico no ponto de atendimento (POC) mais simples, rápidos e baratos e oferecem amplo potencial para triagem de doenças em nível populacional1,2. Embora numerosos LFAs para anticorpos de coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2)3,4,5 e antígenos6,7 tenham sido introduzidos, nenhum tem sensibilidade e quantificação comparáveis ​​aos diagnósticos laboratoriais, como PCR em tempo real com transcrição reversa (RT–PCR) e ensaio imunoenzimático (ELISA)8,9,10. Em geral, os LFAs colorimétricos convencionais são aproximadamente 1.000 vezes menos sensíveis do que esses testes laboratoriais padrão11,12, e o diagnóstico usando LFAs requer um teste laboratorial confirmatório adicional para estabelecer corretamente os resultados negativos. Os LFAs colorimétricos são muitas vezes inadequados para leituras quantitativas, devido a alterações limitadas na cor em relação à variação da concentração do analito alvo13.

A pandemia da doença de coronavírus 2019 (COVID-19) destacou a necessidade de LFAs aprimorados para diagnósticos clínicos precisos e rápidos, triagens em massa e estudos epidemiológicos14,15. RT–PCR16,17 e testes diretos de antígeno18,19 têm sido a base para o diagnóstico de COVID-19, e ensaios sorológicos são importantes para a determinação do estágio da infecção e eficácia da vacina e para estudos epidemiológicos3,20,21. Esses ensaios de diagnóstico estão disponíveis apenas em laboratórios de microbiologia qualificados e permanecem dependentes de especialistas, trabalhosos e demorados. Essas limitações impediram os milhões de testes por dia necessários durante surtos epidemiológicos22,23. Portanto, existe uma necessidade crítica de ferramentas de diagnóstico e triagem que não sejam apenas tão precisas quanto os ensaios laboratoriais, mas também rápidas, fáceis de usar, baratas, prontamente disponíveis (para uso domiciliar e POC) e escaláveis ​​para rápida população triagem de nível.

Esforços para melhorar o desempenho bioanalítico dos LFAs incluíram o uso de moléculas fluorescentes ou pontos quânticos como elementos repórteres24,25. Embora os repórteres fluorescentes melhorem a quantificação, sua intensidade de sinal relativamente fraca limita sua sensibilidade e utilidade de diagnóstico POC, e sua baixa absorção de luz em comparação com as nanopartículas de ouro coloidal convencionais (AuNPs)26 impede a detecção visual direta que os LFAs convencionais permitem. Além disso, eles requerem o uso de leitores LFA com detectores altamente sensíveis ou fontes de luz de excitação potentes. Essas considerações limitam a utilidade dos LFAs fluorescentes na triagem em massa e em ambientes com recursos limitados10.

Prevemos um LFA 'bimodal' no qual uma triagem inicial pode ser realizada com um teste visual e testes quantitativos subsequentes podem ser realizados quando necessário na mesma tira de LFA usando um leitor de fluorescência. Para conseguir isso, usamos uma construção em nanoescala fluorescente ultrabrilhante que introduzimos recentemente27, chamada flúor plasmônico, como um repórter bimodal colorimétrico e fluorescente em LFAs (Fig. 1a). Essas construções em nanoescala aproveitam a fluorescência aprimorada por plasmon28,29,30,31,32 para obter um sinal de fluorescência quase 7.000 vezes mais brilhante em comparação com os fluoróforos moleculares convencionais. Conjugamos flúor plasmônico com anticorpos de detecção e os usamos para permitir a detecção colorimétrica e fluorescente rápida e ultrassensível de analitos, usando interleucina-6 humana (IL-6) (limite de detecção (LOD), 93 fg ml-1), SARS-CoV -2 S1 (subunidade da proteína spike) anticorpos (LOD, 185 pg ml-1) e proteína do antígeno SARS-CoV-2 (nucleocapsídeo (N)) (LOD, 212 pg ml-1). Validamos a eficácia clínica dos LFAs baseados em flúor plasmônico (p-LFAs) testando amostras de plasma, soro e swab nasofaríngeo (NP) para a detecção de anticorpos SARS-CoV-2 S1, IL-6 e SARS-CoV- 2, respectivamente, e alcançaram alta especificidade e sensibilidade clínica. Também demonstramos a capacidade quantitativa de p-LFA usando um scanner portátil autoprojetado compatível com flúor plasmônico para demonstrar sua aplicação POC versátil. Substancialmente, esta tecnologia pode ser prontamente implantada como uma alternativa a um teste baseado em laboratório para o diagnóstico de infecções patogênicas clinicamente relevantes.